166 پایان نامه کارشناسی ارشد بیوتكنولوژی و زیست شناسی با عنوان كوآنزیم زیست

دانلود پایان نامه کارشناسی ارشد بیوتكنولوژی و زیست شناسی با عنوان كوآنزیم

دانلود

سایت فایلینا بروز ترین وب در زمینه مقالات کاربردی, مهندسی و سایر رشته ها میباشد معتبر # زیست حجم 6/62 کیلوبایت صفحه 166 فرمت doc 145000 پایان نامه کارشناسی ارشد بیوتكنولوژی و زیست شناسی با عنوان كوآنزیم ایزوپرنوئیدها از بزرگترین تركیبات آلی در طبیعت بوده كه دارای نقشهای گوناگون بیولوژیكی در بدن موجودات زنده از جمله انسان می باشند دانلود پایان نامه کارشناسی ارشد بیوتكنولوژی و زیست شناسی با عنوان كوآنزیم     چكیده: ایزوپرنوئیدها از بزرگترین تركیبات آلی در طبیعت بوده كه دارای نقشهای گوناگون بیولوژیكی در بدن موجودات زنده از جمله انسان می باشند، از اینرو این تركیبات از اهمیت بسیار بالایی از نظر پزشكی و غذایی و حتی دارویی برخوردار هستند. از جمله مهمترین این تركیبات می توان به یوبی كینونها اشاره نمود كه هنگام تنفس سلولی در زنجیره انتقال الكترون دارای نقش بسیار مهمی می باشند. این تركیبات هموپلیمرهایی از واحدهای ایزوپرنی به نام ایزوپنتیل پیرو فسفات (IPP) با ویژگی های ساختاری و فیزیكوشیمیایی مختلف هستند.   دو آنزیم “فارنزیل دی فسفات سنتاز” و “ژرانیل ژرانیل دی فسفات سنتاز” مسئول بیوسنتز دو تركیب “فارنزیل دی فسفات” و “ژرانیل ژرانیل دی فسفات” كه به ترتیب هر كدام از 3 و 4 واحد ایزوپرنی تشكیل شده اند. این تركیبات می توانند به عنوان سوبسترا جهت سنتز دیگر تركیبات ایزوپرنوئیدی و از جمله كوآنزیم Q1 مورد استفاده قرار گیرند.در این مطالعه، تاثیر بیان ژنهای کد کنندهء آنزیم “ژرانیل ژرانیل دی فسفات سنتاز” به تنهایی و یا همراه با دیگرآنزیمهای مسیر بیوسنتز لیكوپن بر روی آنزیم “دکاپرنیل دی فسفات سنتاز” ( آنزیم مسئول ساخت زنجیرهء ایزوپرنوئید كوآنزیم Q1 ) و در نهایت تولید كوآنزیم Q1 در سویه های نوتركیب باكتری “اشرشیاكلی ” مطالعه می گردد.     کلمات کلیدی: Coenzyme كوآنزیم ایزوپرنوئیدها تركیبات آلی دكاپرنیل دی فسفات سنتاز آگروباكتریوم تومی فاسینس ردوباكتر اسفروئیدس           مواد و روشها: در این پژوهش ژنهای هترولوگوس كد كننده آنزیم “دكاپرنیل دی فسفات سنتاز” (dds) از دو گونهء باكتریایی “آگروباكتریوم تومی فاسینس” (atdds) و “ردوباكتر اسفروئیدس” (rsdds) استخراج شده و بوسیلهء دو پلاسمید جداگانه به درون باكتری اشرشیاكلی سویه DH5α كلون گردیدند كه نتیجهء آن ایجاد توانایی تولید كوآنزیم Q1 در این باكتری بود. در ادامه میزان تولید این تركیب در سلولهای نو تركیب حاصله با دستگاه HPLC مورد ارزیابی قرار گرفت.   به منظور مطالعه اثر آنزیم “ژرانیل ژرانیل دی فسفات سنتاز” به تنهایی و یا همراه با  دیگر آنزیمهای مسیر بیوسنتز لیكوپن بر روی تولید كوآنزیم Q1 نیز؛ ژنهای مربوطه ( crtE, crtB, crtI ) از باكتری “اروینیا هربیكولا” استخراج شده و بوسیله پلاسمیدهای جداگانه به درون سلولهای نوتركیب اشرشیاكلی تولید كنندهء كوآنزیم Q1 كلون گردیدند. سلولهای نوتركیب حاصله در محیط كشت “2YTG” در دمای 3 درجه سانتی گراد كشت داده شدند و سپس تولید كوآنزیم Q1 در هر سلول مورد ارزیابی قرار گرفت.   نتایج: بیان دو ژن atdds و rsdds در باكتری اشرشیاكلی با شناسایی پیك كوآنزیم Q1 توسط دستگاه HPLC مورد تائید قرار گرفت. بطور كلی برای شناسایی و اندازه گیری كوآنزیم Q ها از یك شناساگر اشعهء UV در طول موج 275 نانومتر استفاده می شود.به منظور اندازه گیری غلظت كوآنزیم Q1 تولید شده در سلولهای نوتركیب نیز از منحنی استاندارد كوآنزیم Q1 استفاده گردید.نتایج بدست آمده نشان داد كه بیان ژن كدكنندهء آنزیم “ژرانیل ژرانیل دی فسفات سنتاز” به تنهایی در باكتری نوتركیب اشرشیاكلی كه حاوی یكی از دو ژن atdds و یا rsdds می باشد ، افزایش چشمگیری در میزان تولید كوآنزیم Q1 ایجاد نمی نماید و حتی در بعضی موارد منجر به كاهش تولید نیز می گردد.   از طرف دیگر بیان ژن كدكننده آنزیم “ژرانیل ژرانیل دی فسفات سنتاز” همراه با بیان ژهای كدكنندهء آنزیم های “فیتوئن سنتاز” و “فیتوئن دساتوراز” ، كه همگی در مسیر بیوسنتز لیكوپن وجود دارند، منجر به مشاهدهء نتایج متفاوتی در میزان تولید كوآنزیم Q1 در سلولهای نوتركیب حاوی atdds و یا rsdds شده است. بطوریكه بیان ژنهای كدكنندهء مسیر بیوسنتز لیكوپن زمانی كه با ژن atdds همراه هستند، اثر قابل توجهی در میزان تولید كوآنزیم Q1 نمی گذارند، در حالیكه وقتی این ژنها با ژن rsdds همراه می شوند منجر به افزایش چشمگیری در تولید این تركیب می گردند.         فهرست مطالب چكیده فصل اول (كلیات) 1 1.مقدمه : 2 2.تاریخچه كوآنزیم Q1: 3 3.بررسی ساختمان كوآنزیم Q: 3 4.  بررسی واکنشهای اکسیداسیون و احیاء در كوآنزیم Q1 : 5 5.مسیر بیوسنتز” كوآنزیم Q1 : 7 5-1 مسیر سنتز زنجیرهء ایزوپرنوئیدی: 1 5-2 ساخت حلقهء یوبی كینونی: 11 5-3 اتصال حلقه به زنجیرهء ایزوپرنوئیدی و تغییرات بعدی آن: 11 6.بررسی آنزیم های کلیدی در مسیر سنتز کوآنزیمQ1  : 15 7. تاثیر مسیر بیوسنتز ایزوپرنوِِئیدها برروی تولید یوبی كینون ها: 22 7-1 مسیر بیوسنتز لیكوپن: 23 8.نقص كوآنزیم Q1 : 26 9.نقش كوآنزیم Q1 : 27 1 اثرات داروهای استاتینی بر روی بیوسنتز كوآنزیم Q1: 37 11 اهداف پژوهش : 4 12. استراتژی پژوهش : 41 13. نكات مهم پژوهش : 49   فصل دوم (مواد و روشها) 51 ◙ مواد مورد استفاده در این پژوهش: 52 1 اسامی ژن های مورد استفاده: 52 اسامی پلاسمید های مورد استفاده: 52 3 آنزیم های مورد استفاده: 53 4 دستگاههای مورد استفاده در این پژوهش: 53 5 كیت های مورد استفاده در این پژوهش: 56 6 مواد ومحلول های مورد استفاده در این پژوهش : 57 ◙ روش ها: 6 1. تهیه انواع محیط كشت: 6 2. استفاده از انواع آنتی بیوتیك ها در محیط های كشت : 63 3. تهیه سلول مستعد: 64 4. انتقال ژن خارجی به سلول های مستعد : 67 5. تكنیك PCR: 69 6 الكتروفورز با ژل آگارز : 73 7. خالص سازی ژن از ژل آگارز : 79 8 استفاده از آنزیم های برش دهنده: 81 9. خالص سازی نمونه DNA از آنزیم های موجود در محیط واكنش: 84 1 استخراج پلاسمید : 85 11. استخراج كوآنزیم Qاز باكتری تولید كننده: 88 12. محاسبه وزن خشك سلول : 91 13. دستگاه “pH متر”: 92 14. دستگاه “اسپكتروفتومتر” : 93 .15. دستگاه تبخیر كننده: 94 16 كروماتوگرافی “HPLC”: 94   فصل سوم (نتایج) 98 1.ساخت پلاسمیدهای نوترکیب: 99 1-1. ساخت پلاسمید “pDcrtE” 99 1-2. ساخت پلاسمید “pTcrtE” : 17 1-3. ساخت پلاسمید “pTlycm3” 11 1-4.ساخت پلاسمید “pBrsdds” : 118 1-5. تکثیر پلاسمید “pBatdds” 126 2. ساخت سلولها: 127 2-1  ساخت سلول E.coli-Ba: 128 2-2  ساخت سلول E.coli-Br: 129 2-3 ساخت سلول E.coli-BaDc: 129 2-4. ساخت سلول E.coli-BrDc: 129 2-5. ساخت سلول E.coli-BaTc: 129 2-6. ساخت سلول E.coli-BrTc: 13 2-7. ساخت سلول E.coli-BaTl: 13 2-8. ساخت سلول E.coli-BrTl: 13 3 اندازه گیری كوآنزیمQ1 سنتز شده در سلولهای نوتركیب: 13 3-1 انتقال سلول ها به محیط كشت : 131 3-2 استخراج كوآنزیم  Qسنتز شده از سلول های نوترکیب: 133 3-3 اندازه گیری كوآنزیم Q با روش كروماتوگرافی “HPLC” : 133 4.نتایج و یافته ها : 141 5 بحث و بررسی : 146 6. پیشنهادات: 15   فصل چهارم (منابع) 151 منابع انگلیسی : 152 منابع فارسی: 162       فهرست تصاویر فصل اول تصویر شماره 1-1 شمای ساختار انواع كوآنزیم Q ………………………………………………………….3 تصویر شماره 1-2 شمای ساختار كوآنزیم Q3 ……………………………………………………………….4 تصویر شماره 1-3 شمای ساختار سمی كینون ………………………………………………………………..5 تصویر شماره 1-4 شمای ساختار یوبی كینول ………………………………………………………………..5 تصویر شماره 1-5 سیكل كوآنزیم Q …………………………………………………………………………..6 تصویر شماره 1-6 شمای مسیر موالونات و غیر موالونات تا سنتز كوآنزیم Q1………………………….9 تصویر شماره 1-7 شمای ساخت حلقه یوبی كینونی …………………………………………………………..11 تصویر شماره 1-8 مسیر سنتز كوآنزیم Q1 …………………………………………………………………12 تصویر شماره 1-9 مراحل بیوسنتز كوآنزیم Q در باكتری “اشرشیاكلی” و مخمر “ساكارومایسس سرویزیه”…..13 تصویر شماره 1-1 مسیر بیوسنتز لیكوپن…………………………………………………………………….25 تصویر شماره 1-11 زنجیره انتقال الكترون در یوكاریوتها…………………………………………………..29 تصویر شماره 1-12 شمای نقش كوآنزیم Q1 در شكل گیری باند دی سولفیدی …………………………..3 تصویر شماره 1-13 شمای نقش كوآنزیم Q1 به عنوان عامل اكسید كننده سولفید…………………………31 تصویر شماره 1-14 شمای ارتباط مسیر سنتز كوآنزیم Q با مسیر سنتز كلسترول…………………………38 تصویر شماره 1-15 شمای پلاسمید pBBR1MCS2……………………………………………………….43 تصویر شماره 1-16 شمای پلاسمید pBAD24 ………………………………………………………………44 تصویر شماره 1-17 شمای عملكرد پروموتور آرابینوز در وكتور pBAD24……………………………..46 تصویر شماره 1-18 شمای پلاسمید pTrc99A ……………………………………………………………..46 فصل دوم تصویر شماره 2-1 تصویر محیط كشت جامد موجود در plate …………………………………………….6 تصویر شماره 2-2 دستگاه PCR ……………………………………………………………………………..69 تصویر شماره 2-3 دستگاه الكتروفورز ……………………………………………………………………….73 تصویر شماره 2-4 دستگاه pH متر…………………………………………………………………………….92 تصویر شماره 2-5 دستگاه اسپكتروفتومتر……………………………………………………………………..93 تصویر شماره 2-6 دستگاه تبخیر كننده ………………………………………………………………………..94 تصویر شماره 2-7 دستگاه HPLC ……………………………………………………………………………95 فصل سوم تصویر شماره 3-1 توالی ژن crtE …………………………………………………………………………..1 تصویر شماره 3-2 شمای مراحل ساخت پلاسمید pDcrtE …………………………………………………11 تصویر شماره 3-3 نمای الكتروفورز ژل آگارز پلاسمید pBAD24 ……………………………………….11 تصویر شماره 3-4 شمای دو پرایمر برگشتی و پیشرونده برای تكثیر ژن crtE …………………………..13 تصویر شماره 3-5 نمای الكتروفورز ژل آگارز ژن crtE ………………………………………………….13 تصویر شماره 3-6 پلاسمید خطی شده pBAD24 ……………………………………………………………14 تصویر شماره 3-7 نمای الكتروفورز ژل آگارز آماده سازی ژن و پلاسیمد برای ساخت پلاسمید pDcrtE ……15 تصویر شماره 3-8 شمای پلاسمید pDcrtE ………………………………………………………………….16 تصویر شماره 3-9 نمای الكتروفورز ژل آگارز كنترل پلاسمید pDcrtE………………………………….16 تصویر شماره 3-1 شمای مراحل ساخت پلاسمید pTcrtE ……………………………………………….17 تصویر شماره 3-11 نمای الكتروفورز ژل آگارز پلاسمید pTrc99A …………………………………….17 تصویر شماره 3-12 نمای الكتروفورز ژل آگارز پلاسمید خطی شده pTrc99A …………………………18 تصویر شماره 3-13 نمای الكتروفورز ژل آگارز آماده سازی ژن و پلاسیمد برای ساخت پلاسمید pTcrtE …..19 تصویر شماره 3-14 شمای پلاسمید pTcrtE ………………………………………………………………..19 تصویر شماره 3-15 نمای الكتروفورز ژل آگارز كنترل پلاسمید pTcrtE ………………………………..11 تصویر شماره 3-16 توالی ژن crtB …………………………………………………………………………111 تصویر شماره 3-17 توالی ژن crtI …………………………………………………………………112 و 113 تصویر شماره 3-18 شمای مراحل ساخت پلاسمید pTlycm3 ……………………………………………..113 تصویر شماره 3-19 نمای الكتروفورز ژل آگارز پلاسمید pTlycm4 ……………………………………..114 تصویر شماره 3-2 نمای الكتروفورز ژل آگارز 3 ژن موجود در پلاسمید pTlycm4 ………………….115 تصویر شماره 3-21 نمای الكتروفورز ژل آگارز 3 ژن جدا شده از پلاسمید pTlycm4 …………………115 تصویر شماره 3-22 نمای الكتروفورز ژل آگارز آماده سازی ژن و پلاسیمد برای ساخت پلاسمید pTlycm4…116 تصویر شماره 3-23 نمای الكتروفورز ژل آگارز پلاسمید خطی شده pTrc99A پس از خالص سازی …117 تصویر شماره 3-24 شمای پلاسمید pTlycm3 ……………………………………………………………..117 تصویر شماره 3-25 نمای الكتروفورز ژل آگارز كنترل پلاسمید pTlycm3 ……………………………..118 تصویر شماره 3-26 توالی ژن rsdds ……………………………………………………………………….119 تصویر شماره 3-27 شمای مراحل ساخت پلاسمید pBrsdds ……………………………………………..12 تصویر شماره 3-28 نمای الكتروفورز ژل آگارز پلاسمید pTrsdds ……………………………………..121 تصویر شماره 3-29 نمای الكتروفورز ژل آگارز ژن rsdds جدا شده از پلاسمید pTrsdds ……………122 تصویر شماره 3-3 نمای الكتروفورز ژل آگارز ژن rsdds خالص سازی شده ………………………….122 تصویر شماره 3-31 نمای الكتروفورز ژل آگارز پلاسمید pBBR1MCS2 ……………………………..123 تصویر شماره 3-32 نمای الكتروفورز ژل آگارز پلاسمید خطی شده pBBR1MCS2 ………………….124 تصویر شماره 3-33 نمای الكتروفورز ژل آگارز پلاسمید خطی شده pBBR1MCS2 خالص سازی شده………124 تصویر شماره 3-34 شمای پلاسمید pBrsdds ……………………………………………………………….125 تصویر شماره 3-35 نمای الكتروفورز ژل آگارز كنترل پلاسمید pBrsdds ………………………………..125 تصویر شماره 3-36 توالی ژن atdds ……………………………………………………………………….126 تصویر شماره 3-37 شمای پلاسمید pBatdds ………………………………………………………………127 تصویر شماره 3-38 شمای مراحل ساخت سلولهای نوتركیب …………………………………………………128 تصویر شماره 3-39 پیك مربوط به كوآنزیم Q1 استاندارد شناسایی شده توسط دستگاه HPLC ……….135 تصویر شماره 3-4 پیك مربوط به كوآنزیم Q8 استاندارد شناسایی شده توسط دستگاه HPLC ………..136 تصویر شماره 3-41 پیك مربوط به كوآنزیم Q9 استاندارد شناسایی شده توسط دستگاه HPLC ………..136 تصویر شماره 3-42 پیك كوآنزیم Q شناسایی شده در نمونه مجهول توسط دستگاه HPLC………………137 تصویر شماره 3-43 پیك كوآنزیم Q شناسایی شده در نمونه مجهول توسط دستگاه HPLC………………147     فهرست جداول فصل اول جدول شماره 1-1 انواع ژنهای كد كننده مسیر بیوسنتز كوآنزیم Q در “اشرشیاكلی” و “ساكارومایس سرویزیه”…..15 جدول شماره 1-2 انواع آنزیم های “پلی پرنیل دی فسفات سنتاز”……………………………………………..16 فصل دوم جدول شماره 2-1 نام ژنهای مورد استفاده به همراه ویژگی آنها ………………………………………………52 جدول شماره 2-2 نام پلاسمیدهای مورد استفاده…………………………………………………………………52 جدول شماره 2-3 نام آنزیم های برش دهنده مورد استفاده……………………………………………………..53 جدول شماره 2-4 آنتی بیوتیك های مورد استفاده……………………………………………………………….63 جدول شماره 2-5 ویژگی كامل آنزیم های برش دهنده مورد استفاده…………………………………………..83 جدول شماره 2-6 ویژگی كامل آنزیم DNA T4” لیگاز”……………………………………………………..84 فصل سوم جدول شماره 3-1 اسامی پلاسمیدهای نوتركیب ساخته شده…………………………………………………….99 جدول شماره 3-2 اسامی سلولهای نوتركیب ساخته شده……………………………………………..127 و 128 جدول شماره 3-3 اندازه سطح زیر منحنی نمونه كوآنزیم Q1 استاندارد در غلظتهای مختلف…………..134 جدول شماره 3-4  غلظت كوآنزیم Q1 محاسبه شده در سلولهای نوتركیب ………………………137و 138 جدول شماره 3-5 وزن خشك سلولی محاسبه شده سلولهای نوتركیب……………………………….139 و 14 جدول شماره 3-6 مقدار تولید كوآنزیم Q1 در سلولهای نوتركیب………………………………………….141   فهرست نمودارها فصل سوم نمودار شماره 3-1 منحنی استاندارد كوآنزیم Q1 …………………………………………………………..135 نمودار شماره 3-2 منحنی استاندارد وزن خشك سلولی……………………………………………………….139 نمودار شماره 3-3 اثر ژن crtE ( بر روی وكتور pBAD24 ) در تولید كوآنزیم Q1 …………………142 نمودار شماره 3-4 اثر ژن crtE ( بر روی وكتور pTrc99A) در تولید كوآنزیم Q1 …………………143 نمودار شماره 3-5 اثر ژنهای مسیر بیوسنتز لیكوپن در تولید كوآنزیم Q1 ……………………………….144 نمودار شماره 3-6 اثر ژن crtE و ژنهای مسیر بیوسنتز لیكوپن به هراه ژن atdds در تولید كوآنزیم Q1…145 نمودار شماره 3-7 اثر ژن crtE و ژنهای مسیر بیوسنتز لیكوپن به هراه ژن rsdds در تولید كوآنزیم Q1….145   فهرست معادلات فصل اول معادله 1-1 معادله انتقال الكترون از كوآنزیم Q1 به كمپلكس بعد از آن ……………………………………28 فصل دوم معادله 2-1 معادله محاسبه pH ………………………………………………………………………………….92 فصل سوم معادله 3-1 معادله محاسبه غلظت كوآنزیم Q1 تولید شده در سلولهای نوتركیب………………………….14                 145 كوآنزیم ایزوپرنوئیدها تركیبات آلی دكاپرنیل دی فسفات سنتاز آگروباكتریوم تومی فاسینس ردوباكتر اسفروئیدس دانلود پایان نامه کارشناسی ارشد بیوتكنولوژی و زیست شناسی با عنوان كوآنزیم دانلود پایان نامه كوآنزیم